保存：室温运输，收到后在4℃避光下储存试剂

重要提示：West ECL是一款增强型化学发光(ECL)HRP底物，可帮助用户在免疫印迹分析过程中实现低皮克级的蛋白检测。

其灵敏度和使用方法与Thermo Scientific化学发光产品一样

一抗稀释度范围从1ug/ml储备液起1:1000-1:5000或0.2-1.0ng/ml     

二抗稀释度范围从1 u g/ml储备液起1:20000-1:100000或10-50ng/ml

与West ECL化学发光底物，一起使用的抗体稀释度范围

产品简介

West底物可为使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联物的免疫印迹实验提供明亮的信号和低皮克级检测灵敏度。

该ECL底物能够兼容各种膜、封闭液和宽范围抗体稀释液，以出色性能、通用性和高性价比，满足用户的免疫印迹应用需求。

West底物的特点：

• ECL —用于辣根过氧化物酶(HRP)的增强型化学发光底物

• 低皮克级灵敏度—检测硝化纤维素膜或PVDF膜上低皮克级的蛋白条带

• 长信号持续时间— 在条件优化情况下，经底物孵育的印迹条带能够持续输出6至8小时的可检测光信号

• 稳定试剂— 工作液在24小时内保持稳定；试剂盒在室温下可稳定放置长达1年

• 价格经济— 针对稀释的抗体浓度条件进行了优化：

• 0.2至 1.0 µg/mL一抗（以1 µg/mL储存液稀释1:1,000至1:5,000倍）

• 10至 50 ng/mL二抗（以1 µg/mL储存液稀释1:20,000至1:100,000倍）

重要提示:

Ø 为获得最佳效果，必须优化该系统的全部组分，包括样品量、一抗和二抗浓度以及膜和封闭试剂的类型。

Ø 使用该产品比使用沉淀比色HRP底物检测所需的抗体浓度低。为优化抗体浓度，请进行一次系统的点印迹分析。

Ø 没有一种封闭试剂对所有系统而言都是最佳的，所以为每一个免疫印迹检测系统找到最合适的封闭缓冲液非常必需。

封闭试剂有可能与抗体产生交叉反应，导致出现非特异性信号。封闭缓冲液同时也会影响系统的灵敏性。

当从一种底物转换为另一种底物时，有时会出现信号衰减或背景增加的现象，原因可能是封闭缓冲液不适合新的检测系统。

Ø 使用亲和素/生物素检测系统时，避免使用牛奶作为封闭试剂，因为牛奶中含有不定量的内源性生物素，会导致高背景信号。

Ø 保证洗涤缓冲液、封闭缓冲液、抗体溶液和底物工作液的使用体积，以确保在整个实验过程中印迹膜完全被液体覆盖，避免膜变干。

增大封闭缓冲液及洗涤缓冲液的使用量可以降低非特异性的信号

Ø 为获得最佳效果，在孵育步骤请使用摇床。

Ø 将Tween20(终浓度0.05-0.1%)加入封闭缓冲液和稀释的抗体溶液，以降低非特异信号。使用高品质的产品，如去污剂。

它保存在安瓿中，过氧化物和其他杂质含量很低。

Ø 不要使用叠氮钠作为缓冲液的防腐剂。叠氮钠是HRP的抑制物

Ø 避免手与膜直接接触，实验过程应戴手套或使用干净的镊子

Ø 所有设备必须清洁且不沾染外来物质。金属器械（如剪刀）不得具有可见的锈迹。锈迹可能导致斑点形成和高背景。

Ø 底物工作液在室温下可稳定8小时。日光或任何其他强光下可能损害底物，为获得最佳结果，将底物工作液保存在琥珀色瓶中，

并避免长期暴漏在任何强光下，短时间暴漏于实验室常规照明不会损害该工作液

操作概述

注：优化抗原和抗体的浓度。必须使用建议的抗体稀释度，以保证阳性结果。有关建议的稀释度范围请参考其他所需材料。

1) 将一抗浓度稀释到0.2～1ug/ml

2) 将二抗浓度稀释到10～50ng/mL

3) 将两种底物组份按1:1比例混合，制备底物工作液。

注：暴漏于日光或任何其他强光可能损害工作液，为获得最佳结果，将此工作液保存在琥珀色瓶中，

并避免长期暴漏于任何强光。短时间暴漏于实验室常规照明不会损害该工作液。

4) 将印迹膜在West ECL底物工作液中孵育5分钟。

5) 吸出多余试剂。用清洁的塑料膜盖住该印迹膜。

6) 使印迹膜在X光胶片上曝光。

其他所需材料

l 已完成转印的印迹膜：用合适的电泳法分离蛋白质，并将这些蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。

l 稀释缓冲液：使用Tris或磷酸盐缓冲液。

l 洗涤缓冲液：将5mL 10%的Tween-20加入1000mL稀释缓冲液（Tween-20的终浓度将0.05%）。

l 封闭试剂：将0.5mL10%的Tween-20加入100mL的封闭缓冲液，选择一种与稀释缓冲液具有相同基本组分的封闭缓冲液。

l 一抗： 选择一种目标蛋白质特异性抗体。使用稀释缓冲液制备该抗体的1ug/ml储备液。

使用封闭试剂将抗体从储备液稀释成抗体工作液。稀释度介于1:1000和1:5000之间或抗体工作液浓度为0.2～1ug/ml.

最佳稀释度取决于一抗和膜上的抗原量。

l HRP标记的二抗：选择一种与二抗特异性结合的HRP标记二抗，使用稀释缓冲液制备该抗体的1ug/ml储备液。

使用封闭试剂将抗体从储备液稀释成抗体工作液。稀释度介于1:20000和1:100000之间或抗体工作液浓度为10～50ng/ml。

该浓度范围在使用链亲和素-HRP时也适用。二抗的最佳稀释度取决于HRP标记二抗和膜上的抗原量。

l 用于处理放射显影胶片的胶片暗盒、显影和定影试剂

l 用于孵育的旋转摇床。

蛋白印迹法详细操作步骤

1) 将印记膜从蛋白转印设备中取出，加入合适的封闭液在温室下孵育20-60分钟，同时振荡。

以封闭膜上非特异性蛋白结合位点。请注意：使用在前文建议的抗体稀释度是非常重要的。

2) 将膜从封闭液中取出，与一抗工作液在温室孵育1小时，同时振荡；或在28℃孵育过夜，不振荡。

3) 将足量的洗涤缓冲液加至膜上，保证缓冲液将膜完全覆盖。振荡孵育≥5分钟，

更换洗涤缓冲液并重复该步骤4-6次。增加洗涤缓冲液体积，洗涤次数和洗涤时间有助于降低背景信号。

注：孵育前，膜在洗涤缓冲液中的短暂淋洗会提高洗涤效率。

请注意：使用在前文建议的HRP标记二抗稀释度是非常重要的。

4) 将HRP标记的二抗工作液与膜在温室孵育1小时，同时振荡。

5) 重复步骤3，以除去未结合的HRP标记二抗。注：膜与HRP标记二抗孵育后必须进行彻底洗涤。

6) 将A溶液与B液等比例混合，制备成工作液。每cm²膜使用0.01～0.1ml工作液。工作液可以在温室下稳定8小时。

注：暴漏雨日光或任何其他强光下可能损害工作液，为获得嘴角结果，将此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免长期暴漏雨任何强光。

实验室的常见照明不会损害工作液。

7) 将印记膜在工作液中孵育5分钟。

8) 从工作液中取出印记膜，并置于一个塑料片或清洁的塑料纸（膜）中，用一张吸水纸吸除多余的液体，并从印记和塑料纸之间小心地压出气泡。

9) 将包在塑料纸（膜）中的印记膜置于胶片暗盒中，蛋白质面朝上，除适用于胶片曝光的灯（如红色安全灯）之外，关闭所有的灯。

注;胶片必须在曝光期间保持干燥，为获得最佳效果，才去一下措施：

*   确保将多余的底物从膜和塑料纸上完全去除。

*   在整个胶片处理期间，使用手套。

*   切莫将印记膜置于已显影的胶片上，因为胶片上的化学物质会减弱信号。

10) 将X光胶片置于膜的上面。建议第一次曝光60秒。之后可调整曝光时间以达到最佳结果。

化学发光反应在底物孵育后的前5-30分钟期间是最强烈的。这一反应可以持续几个小时，但强度会随时间下降，如有底物孵育后较长时间后曝光，

曝光时间可能需要延长以获得较强信号。如果使用磷光存储成像设备（如Bio-Rad的分子成像仪系统）或CCD照相机可能需要较长的曝光时间。

警告：胶片与膜之间的任何移动可能在胶片上造成人为的非特异信号。

11) 使用合适的显影剂和定影剂对胶片进行显影。如果信号太强，则缩短曝光时间或将印记膜进行剥离并降低抗体浓度重新检测。

常见问题及解决方案

*为检测系统活性，在暗室中，在一个清洁试管中制备1-2ml底物工作液。关闭灯，添加1ul未稀释的HRP标记二抗工作液。

该溶液应当立即发出蓝色光，蓝光信号在随后的几分钟渐淡。