超氧化物检测试剂盒

Superoxide Assay Kit

产品说明：

超氧化物检测试剂盒(Superoxide Assay Kit)是一种用于超氧化物快速高灵敏度检测的试剂盒。本试剂盒利用超氧化物可以还原WST-1产生可溶性有色物质为基础来检测超氧化物。本试剂盒的检测试剂中添加了Catalase(触酶)等，可以清除过氧化氢等过氧化物对WST-1显色的干扰，使测定结果更加准确。并且本试剂盒还提供SOD(超氧化物歧化酶)，可以验证本试剂盒测定出的结果是否为超氧化物，以排除检测体系中所用的一些试剂可能产生的干扰。对于本试剂盒，加入SOD后通常可以抑制90%以上的超氧化物。

    WST-1是一种类似于MTT的化合物，可以被超氧化物还原生成橙色的formazan。超氧化物产生越多越快，则颜色越深，即相应测定得到的吸光度值越大。使用WST-1作为检测试剂比用传统的细胞色素c(cytochrome c)检测超氧化物具有多方面的优点。首先，WST-1本身的吸光度非常低(通常OD450为0.02左右，因仪器和酶标板不同而有所不同)，而细胞色素c本身的吸光度非常高(通常OD550为0.5左右)，因此，使用WST-1与细胞色素c相比，检测灵敏度高很多倍。其次，WST-1的还原产物是稳定的可溶性产物，且对细胞基本无毒性，使WST-1方法更加适合于高通量的筛选。另外，细胞色素c法由于灵敏度的限制，一般不适合用96孔板测定，而WST-1法可以用96孔板测定，使检测更加便捷。50万/毫升嗜中性粒细胞在37℃用PMA刺激指定时间，用WST-1或细胞色素c方法分别测定。WST-1法测定OD450，而细胞色素c法测定OD550。另外，WST-1法和luminol法相比，灵敏度相近，但仅须使用普通的酶标仪，无须使用luminol法所需的luminometer，并且检测速度也比luminol法更加快捷。

     超氧化物通常指超氧化物阴离子(superoxide anion)O₂.-，是一种氧分子的自由基。在呼吸链中，NADPH氧化酶把电子传递给氧分子的时候，就会产生超氧化物阴离子O₂.-。超氧化物阴离子O₂.-是一种强氧化剂，可以由被刺激的白细胞等产生，从而抵御微生物的感染等。超氧化物阴离子O₂.-也可以导致氧化损伤，和许多疾病的发生密切相关。

本试剂盒可以测定100个样品。

试剂盒组份：

注意事项：

1) WST-1溶液、Catalase溶液和SOD溶液均宜尽量避免反复冻融，可以适当分装。

2) 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

3) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法：

1. 超氧化物检测工作液的配制：

按照下表比例配制超氧化物检测工作液：

2. 悬浮细胞产生超氧化物的检测：

2.1） 细胞用PBS、Hanks液或生理盐水洗涤一次。

2.2）约按5-10万个细胞/毫升的比例，用超氧化物检测工作液悬浮细胞。

2.3）在96孔板中，每孔加入200微升用超氧化物检测工作液悬浮的细胞，每孔约1-2万个细胞。

2.4）37℃孵育3分钟。

2.5）在预定的检测孔中加入预计可以诱导产生超氧化物的刺激物，如PMA等，刺激10-60分钟或其它预定的时间。须至少留一个不加刺激物的孔作为空白对照。选择1-2个加刺激物的孔中加入2微升SOD以验证整个检测体系，加SOD溶液的检测可以不做。试剂盒提供的SOD溶液足够做10个检测。具体检测时的安排参考下表：

2.6） 在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长作为参考波长进行双波长测定。

3. 贴壁细胞产生超氧化物的检测：

3.1） 约按每孔5000-10000个细胞(具体的细胞接种数量须根据细胞的大小和生长速度自行确定)把细胞培养到96孔板中，使第二天或待检测时细胞为80-90%满。

3.2） 吸去培养液，用PBS、Hanks液或生理盐水洗涤一次。

3.3） 每孔加入200微升超氧化物检测工作液，37℃孵育3分钟。

3.4）在预定的检测孔中加入预计可以诱导产生超氧化物的刺激物，如PMA等，刺激10-60分钟或其它预定的时间。须至少留一个不加刺激物的孔作为空白对照。选择1-2个加刺激物的孔中加入2微升SOD以验证整个检测体系，加SOD溶液的检测可以不做。试剂盒提供的SOD溶液足够做10个检测。具体检测时的安排参考下表：

3.5） 在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长作为参考波长进行双波长测定。